双向电泳样本制备技术服务

  
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主要仪器
细胞超声破碎仪、超声清洗仪、低温高速离心机、核酸蛋白定量仪、研钵、震荡混合器、低温及超低温冰箱、组织匀浆器、细胞刮等。
试剂耗材
250mM蔗糖水(蔗糖250mM/Tris-HCl 20mM pH7.4)、液氮、丙酮、TCA、BCA定量试剂盒、玻璃珠(0.4-0.6mm)、研磨沙、DTT、TPB、IAA、PMSF、裂解液(7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、20mMTris-HC pH7.4)、再水化液(7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS) IPG buffer、溴酚蓝等。
注:1.除蛋白定量及特别提示外,操作均在冰上进行;2.亚细胞组分及特殊组织提取不包括在本方法中。
 
一.培养细胞的样本制备
1. 贴壁细胞:弃培养基、吸干;用250mM 4蔗糖水洗涤两次吸干;10cm培养皿加300μl裂解液1% IPG buffer,用细胞刮刮下细胞后收集在1.5ml EP管中。
   悬浮细胞:离心、弃培养基;用250mM蔗糖水洗涤两次,尽量吸掉残夜;108细胞用300μl裂解液、1% IPG buffer,转移到1.5ml EP管中。
2. 细胞超声破碎仪超声,0.8秒开/3.2秒关,10次。
3. 20000g、4℃、20分钟离心,将蛋白层转移到新EP中。
4. 4倍体积丙酮(-20℃预冷),摇均后-20℃过夜。
5. 12000g、4℃、30分钟离心,倒掉丙酮,吸干。
6. 等管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸头搅碎蛋白块,超声帮助溶解。
7. BCA法定量
 
二.动物组织的样本制备
1.将100mg左右组织剪碎,250mM 4蔗糖水洗尽血色。离心去掉蔗糖水。
2.软组织:加300μl裂解液、5mMTPB、1% IPG buffer及PMSF后在机械匀浆器中匀浆至不见组织块。硬组织:液氮研磨至粉末状,收集到EP管中加300μl裂解液、5mMTPB、1% IPG buffer及PMSF裂解。
3.细胞超声破碎仪超声,0.8秒开/3.2秒关,10次。
4. 20000g、4℃、20分钟离心,将蛋白层转移到新EP管中。
5. 4倍体积丙酮(-20℃预冷),摇均后-20℃过夜。
6. 12000g、4℃、30分钟离心,倒掉丙酮,吸干。
7.管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸头搅碎蛋白块,超声帮助溶解。
8.BCA法定量
 
三.细菌的样本制备
1. 将25ml细菌样本常温离心,弃培养基,吸干;10ml 37 250mM蔗糖水洗涤两次,1ml再次重悬,转移至1.5EP管中洗涤;加300μl裂解液、1% IPG buffer。
2.细胞超声破碎仪超声,0.8秒开/3.2秒关,15次。
3. 20000g、4℃、20分钟离心,将蛋白层转移到新EP管中。
4. 4倍体积丙酮(-20℃预冷),摇均后-20℃过夜。
5. 12000g、4℃、30分钟离心,倒掉丙酮,吸干。
6.管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸头搅碎蛋白块,超声帮助溶解。
7.BCA法定量。
 
四.真菌的样本制备
1. 收集真菌,弃培养基,吸干;冷ddH2O洗涤两次,转移至1.5ml EP管中,去掉ddH2O,加300μl裂解液、1% IPG buffer及PMSF、玻璃珠。
2. 将上述EP管剧烈震荡2min,然后冰上放置2min;重复5次。
3. .细胞超声破碎仪超声,0.8秒开/3.2秒关,十次。
4. 20000g、4℃、20分钟离心,将蛋白层转移到新EP管中。
5. 4倍体积丙酮(-20℃预冷),摇均后,-20℃过夜。
6. 12000g 4℃ 离心30分钟,倒掉丙酮,吸干。
7.管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸头搅碎蛋白块,超声帮助溶解。
8.BCA法定量。
 
五.植物叶子的样本制备
1. 取200mg叶子ddH2O洗净后迅速放入研钵(-20预冷)中,用液氮研磨4遍,可加入研钵沙,研磨至粉末状。
2. 10倍体积-20℃预冷的丙酮(含有10%TCA和50mM DTT)中,摇匀,-20℃过夜沉淀。
3. 2000g、4℃、30分钟离心,倒掉丙酮,吸干。
4. -20℃预冷的丙酮洗涤沉淀3次。
5. 200μl再水化液,用吸头搅碎蛋白块,超声帮助溶解。
6. 12000g、4℃、20分钟离心,取蛋白层。
7. BCA法定量。
 
六.血浆的样本制备
参见去除高丰度蛋白说明书。
 
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