双向电泳实验技术服务资料

  
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主要仪器:
离心机、GE HealthCare双向电泳系统、摇床、A4投射扫描仪、Typhoo9400扫描仪等。
 
试剂耗材:
见最后页。
 
DIGE标记:
注:此为可选步骤,全程4℃、暗处操作。
1. 配好10 mM lysine,准备1ml DMF。
2. 样本要求,样本浓度在5-10μg/μl之间。样本可以根据其浓度稀释至该范围后再定量一次。样本需溶解在7M urea、2M Thiourea 、4%charps、30mM Tris-HCl pH8.5(4℃)中。
3. 配储液,染料复温5mim,离心使粉末落至管底。将染料溶于5μl DMF中,震荡30s,离心恢复体积。此时其浓度为1nM/μl。取本实验所需量后用封口胶封严管口。
4. 配工作液,以一个样本为例: 0.4μl储液加0.6μl DMF混合,此时其浓度400pM/μl。
5. 标记,取50μg样本和1μl 工作液混合。反应30min。
6. 终止反应,1μl 10 mM lysine 混合后终止反应10min。
 
IEF电泳步骤:
1. 检查胶条槽,等电聚焦仪是否水平。
2. 准备上样液:上样量、上样体积、再水化液、DTT、BPB。
3. 将460μl上样液混合均匀后,12000g离心8分钟,取上层450μl用1ml枪将其均匀的加在胶条槽两电极间,必须无间断、无气泡。
4. 取出IPG干胶条,从正极端开始小心撕下保护膜,撕到负极端时应缓慢。将其正极端顶入胶条槽的正极端,胶面朝下缓缓放入槽内,尽量使液体分布均匀,不能有气泡。记下胶条编号和样本号。
5. 均匀覆盖1ml覆盖油。盖上盖子
6. 编辑IPGphor的IEF程序:
      电流设置 50μA
 Step 1: 30v     10-12h, step-n-hold.
 Step 2: 500v    1h       step-n-hold.
 Step 3: 1000v   1h       step-n-hold.
 Step 4: 8000v   10h      step-n-hold.
选择胶条总数。
Total:20-24h,<100 000vh。根据实际情况调整参数。
注:血清等高盐样本第二、第三步各延长一小时,并增加1000-8000v的gradient步骤;DIGE电泳应避光
7. IEF完成时,记录总时间、总vh及8000v时间、vh等。胶条放入平衡管中,-80℃保存。
 
灌胶:
1. 准备干净玻璃板:铲胶后用洗洁精洗干净,1%Decon浸泡(6块板1000ml)过夜,海绵刷洗,自来水冲干净,1%盐酸浸泡过夜,海绵刷洗,冲洗干净,ddH2O涮洗。晾干。
2. 配Bind-silane工作液:每100ml含乙醇80ml、冰醋酸2ml、水18ml、Bind-silane 100μl。
3. 用少量酒精将玻璃板擦干净,用无尘纸将纸毛擦净。
4. 加3.5ml Bind-silane 工作液。涂匀,注意不能涂到space上面。1h后用涂再涂湿,去除尘埃。
5. 合玻璃板。将短板用酒精擦干。合上后能在水平面上站立位标准。
6. 准备灌胶槽。塑料片、槽内侧面、橡胶垫等不能沾水。在放海绵条的沟上挤满dd水,将海绵条按进沟内,使其充分泡胀,注意不要来回扯动。
7. 对好橡胶垫子,使其处于槽中间。
8. 在槽底面放一厚塑料片(注意圆角端朝外),然后玻璃板、厚塑料板依次放置,剩余空间用薄塑料板填满,放置时应不留空隙。
9. 装好灌胶槽盖子。将胶槽竖立于通风厨水平面上。
10. 准备灌胶瓶, 从4℃冰箱里取出moner、resolving buffer 。以6张12.5%胶为例:依次加入175.14ml moner,105ml resolving buffer, 4.2ml 10%SDS, 133.56ml ddH2O。除气15分钟。
11. 试剂柜中拿出APS和TEMED,称好APS 0.21g,溶于2.1ml ddH2O中。
12. 往灌胶瓶中均匀缓和加入APS和138.6μl TEMED。搅拌3分钟。
13. 沿槽斜沟缓缓灌入胶液,直到液面平space上缘。剩余胶液倒入小烧杯中。
14. 加饱和正丁醇(上层液为饱和正丁醇),沿胶面弧线缓缓向前推进滴加。
15. 用薄膜封口。过夜备用。
 
SDS-page电泳步骤:
1. 检查灌胶是否正常。准备好二向胶。
2. 配好电泳缓冲液。用具:2000ml,800ml量筒各一个;5000ml量杯一个。上槽2X 800ml,下槽 1X 4500ml。弃掉二向胶上的水,以上槽缓冲液覆盖之。将一半左右下槽液倒入电泳槽中,开通循环冷却设备。
3. 配置0.5%LM及1%NA的琼脂糖各40ml,煮沸。
4. 取出DTT及IAA复温。
5. 配置分子量Marker。剪好6张1x0.3 cm的滤纸。低分子量:15μl储液,30μl 1x sample buffer,45μl sealing buffer。立即混匀,离心恢复体积,稍煮使琼脂糖溶解,每张滤纸滴加10μl。
6. 取出平衡管复温。注意防止管盖暴脱。
7. 配置平衡液。注意在溶解DTT及IAA时不要产生过多气泡,溶解彻底。
8. 胶条平衡。用具:50ml离心管架子一个。方法:操作在水池边进行,将平衡管立于架子上。用15ml左右dd水涮洗一次。加DTT平衡液10ml后摇荡15分钟,弃液后加IAA平衡液10ml后震荡15分钟。弃液,使平衡管立于架子上。将架子转移至上二向胶工作区。
9. 胶条平衡时。。。。准备上二向胶工作区间,见图:

 

 
加热器
量筒
 
架子
车子:玻璃板架,废液杯,桌布,镊子两把,剪刀,尺子,汲水纸,分子量Marker。
操作者
10. 上二向胶。A:倒弃并汲干缓冲液,注意汲水纸不能触及胶面。B:取3ml左右0.5%琼脂糖填入玻璃板空隙中,液面不要有气泡。C:取出胶条(镊子夹胶条两边)后在上槽液中涮洗,将胶条贴于长玻璃板上,碱性端架于space上,依次剪去酸性端和碱性端,靠尺子重力使胶条下降到与page胶面接触,注意不能有气泡。
11. 将玻璃板放入电泳槽中。琼脂糖将凝固时,左右倾斜进入液面后反复上下冲击可赶走玻璃板下沿气泡。
12. 盖上上槽,用琼脂糖封住上槽与玻璃板之间的空隙。
13. 琼脂糖将凝时,同时加上、下槽液。盖盖,接电源,注意正负极。
14. 电泳程序:2-2.5W/胶 40分钟;17W/胶,6张胶100W,约6小时。
注:DIGE电泳温度10℃,避光
 
染色(每个染色盘需染液500ml
胶体考染:
1. 染色液配置:(0.12%G-250、10%(NH42SO4、20%MeOH。
锥形瓶中加入500mlH2O、100mlH3PO4(产热,缓加混匀)、100g(NH4)2SO4(边加边搅拌)再加1.2g G-250再溶解(其实不能真正溶解,用水定容至800ml,边搅边加入200ml MeOH。终体积1000ml(可保存半年)。充分溶解需较长时间,整个过程约2h.。
2. 染色:固定 40%MeOH+10%HAc 30min-over night。
       漂洗 H2O 15minX4次。
       染色  室温摇荡过夜
       终止 H2O漂洗至背景清楚。
3. 脱色(可选): 50%ACN+50%NH4HCO3(5mM) 2hX2次
                100%ACN    10minX2
                100mM NH4HCO3
热考染:
1. 0.025%R350配置:1片Phast Gel Blue 溶入1.6L10%的acetic acid中。
2. 将染色液加热至90℃,倾倒至凝胶上,摇15min。
3. 脱色:10%acetic acid 脱色至背景发白,点清晰可见。
EMBL 银染:(时间以有一面贴在玻璃板上的胶为例,裸胶时间减半)
1.固定 50%MeOH、5%HA 40min
2.洗涤 50%MeOH          20min
3.洗涤 H2O               ≧2h     洗涤过夜可减少背景。
4.敏化 0.02%Na2S2O3       2min  
5.洗涤 H2O               2min 两次
6.加银 0.1%AgNO3         40min
7.洗涤 H2O               2min 两次
8.显色 0.04%formalin、2%Na2CO3   显色液变黄时立即换液,至可见蛋白点时终止。
9.终止 5%HAc
10.保存 1% HAc
Vorum 银染:(时间以有一面贴在玻璃板上的胶为例,裸胶时间减半)
1.固定 50%MeOH、5%HAc 2h
2.洗涤 35%EtOH 20min    三次
3.敏化 0.02% Na2S2O3       2min
4.水洗 H2O                5min 三次
5.加银 0.2%AgNO3 0.076%Formalin 20min
6.水洗 H2O                1min 两次
7.显色 6% Na2CO3,0.05%formalin,0.0004% Na2S2O3 液体变黄时换液;见点后马上终止
8.终止 50%MeOH,12%HAc 5min
9.保存 1%HAc 4保存。
 
试剂配置:
1. rehydration buffer stock
          Reagent
Quantity
Final concentration
Urea     (MW 60.06)
     10.5g
          7M
Thiourea (MW 76.12)
       3.8g
          2M
CHAPs   (MW614.89)
        1g
          4%(W/V)

Milli-Q 水至25ml,1.2或0.5ml分装,-80℃保存可保存半年。
使用前每2.5ml 加入5µl 1%Bromophenol blue solution,15.4mgDTT,0.5%即12.5µl IPG buffer
 
2. Bromophenol blue solution  
Reagent       
Final concentration
   Amount
Bromophenol blue
1%
    100mg
Tris-base
          50mM
    60mg
Double distilled water
 
 to 10ml
室温保存
3. 4x resollving gel buffer (1.5M Tris-HCl pH8.8 1L)
Reagent       
Final concentration
     Amount
Tris -base (Fw121.1)
       1.5M
    181.7g
Double distilled HO
 
    750ml
HCl       (Fw 36.46)
 
adjust to pH8.8
Double distilled water
 
 to   1L
0.45µm过滤,4ºC保存
 
4. 30%T, 2.6% C monomer stock solution
(30%acrylamide, 0.8%N,N’-methylenebisacrylamide, 200ml)
Reagent       
Final concentration
     Amount
Acrylamide (FW 71.08)
30%
      60.0g
N,N’-methylenebisacrylamide(FW154.17)
0.80%
      1.6g
Double distilled water
 
       to 200ml
0.45µm过滤,4ºC避光保存
 
5. Bind-Silane working solution.
Reagent
Quantity
Ethanol
8 ml
Glacial acetic acid
200µl
Bind-Silane
10µl
Double distilled H2O
1.8 ml
 
6. 10%SDS
Reagent       
Final concentration
     Amount
 SDS (FW 288.38)
           10%(w/v)
       5.0g
Double distilled water
 
       to 50ml
0.45µm过滤,室温保存。
 
7. 12.5%SDS-PAGE凝胶配方
Reagents
Volumn of reagents
1
2
3
4
5
6
Monomer solution
50.04ml
75.06ml
100.08ml
125.1ml
150.12ml
175.14ml
4×resolving gel buffer
30ml
45ml
60ml
75ml
90ml
105ml
10%SDS
1.2ml
1.8ml
2.4ml
3.0ml
3.6ml
4.2ml
Double distilled water
38.16ml
57.24ml
76.32ml
95.4ml
114.48ml
133.56ml
10%ammonium persulfate
600µl
900µl
1200µl
1500µl
1800µl
2100µl
TEMED
39.6µl
59.4µl
79.2µl
99µl
118.8µl
138.6µl
Total volumn
120ml
180 ml
240 ml
300 ml
360 ml
420 ml
 
8. SDS equilibration buffer
(50mM Tris-HCl Ph8.8 , 6M Urea , 30% glycerol , bromophenol blue 200ml )
Reagent       
Final concentration
     Amount
Tris-HCl pH8.8
          50mM
   20.0ml (13.3ml 4x resollving gel buffer)
Urea (MW 60.06)
            6M
     144.14g
Glycerol (87% v/v)  
         30%(v/v)
     138ml
 SDS (FW 288.38)
         2% (w/v)
     8.0g
Bromophenol blue
         0.002%(w/v)
     800µl of 1%solution
Double distilled water
 
     to 400ml(65ml溶解,再加至400ml)
40ml分装,-20ºC保存。
 
9. Equilibration of IPG strips prior to SDS PAGE:
2%SDS. 50mMTris Ph8.8. 6M Urea . 30%(v/v)glycerol .  0.002% bromophemol blue
15 min   10ml +100mgDTT
15 min   10ml +250mgIAA
 
10. 10X SDS electrophoresis buffer 
(250Mm Tris-HCl. pH8.3, 1920mm glycine, 1%SDS, 1L)
Reagent       
Final concentration
     Amount
Tris-base (FW 121.1)
          250mM
     30.3g
Glycine    (FW75.07)
          1920mM
     144.0g
SDS        (FW288.38)
          1%(w/v)
     10.0g
Double distilled water
 
     to 1L
 
11. Agarose sealing solution
Reagent       
Final concentration
     Amount
Upper SDS electrophoresis buffer
 
     100ml
Agarose (LM)
0.50%
      0.5g
Bromophenol blue
0.002%(w/v)
200µl
 
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