质谱样本制备技术服务资料

  
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试剂耗材
Milli-Q waterNon-powder glovesFace maskHat10µl and 200µl tipseppendorf)、Menthol(Fisher M/4056/17)Acetonitrile(Fisher A/0626/17)Trypsin (Promega V528)Trypsin resolve solution(Promega V530)Ammonium bicarbonateSigma A6141)、ZipTip µC-18Millipore ZTC18M096)、TFA(GE HealthCare)0.2ml and 0.5ml EP tube(eppendorf)50ml EP 0.5ml EPCorning
 
用具仪器
真空干燥仪、水浴锅、10µ200µ移液器、废液缸、制冰和装冰设备、200µ管架、剪刀、能装放置了200µ管管架的塑料盒、200µ管离心机。
 
准备
1.      0.2ml EP管三套,MilliQ水和甲醇各涮一遍,真空干燥。
2.      50ml EP管六支,MilliQ水和甲醇各涮一遍,真空干燥。
3.       胰酶储液制备:使胰酶粉末沉落瓶底,用100µ胰酶重旋液溶解,0.5ml EP分装成5µl
4.       50ml 100 mM NH4HCO3
 
脱色酶切
1.      切点200µl tip头剪成吸口1.5mm左右的直径,MilliQ水涮洗一遍,吸100µl水后戳取斑点,将胶粒打入0.2ml EP管中,吸干水后再用MilliQ水洗涤两遍,吸干。
2.      脱色 180µl 50%MeOH/50mM NH4HCO3脱色两次以上,每次半小时;180µl MilliQ水洗涤5分钟,180µ 50% ACN洗涤5分钟,180µl 100%ACN洗涤5分钟;真空干燥半小时。
3.      酶切
A25 mM NH4HCO3稀释胰酶至12.5µg/µl;每管胶粒加入胰酶3µl,冰浴15分钟后洗掉多余的胰酶;再加入3µl左右25 mM NH4HCO3至覆盖胶粒。
B:小心将EP管倒转,将整个EP管架放入塑料盒中后放入37度水浴锅酶切16小时。
C:将塑料盒从37度水中捞出,注意不要倒掉水,冷却至室温。
D:加入10µl 25 mM NH4HCO3,震荡15分钟,离心后收集至新管;
加入10µl 2.5%TFA,震荡5分钟,收集至上管;
加入10µl 2.5%TFA-50% ACN,震荡5分钟,收集至上管;
加入10µl 100% ACN,震荡5分钟,收集至上管。
E:将此收集液真空浓缩至5-10µl后,加入20µl 0.5%TFA;继续浓缩至10-20µl
 
肽段浓缩除盐
A:吸10µl 100% ACN,弃之,重复两次;
B:吸10µl 0.1% TFA,弃之,重复两次;
C:吹吸样本15次;
D:吸10µl 0.1% TFA,弃之,重复两次;
E:吸3µl 0.1% TFA-50% ACN,将此洗脱液转入新EP
 
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