western blot技术服务资料

  
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试剂耗材:
SDS、甘油、Tris、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED,APS、甘氨酸、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量试剂盒、BSA、脱脂奶粉、考麻斯亮蓝、丽春红、氯化钠、氯化钾、DTT、ECL、显影液、定影液等、显影胶片。
 
仪器设备:
超声仪、核酸蛋白定量仪、Western-blot电泳转膜系统、摇床、曝光合、红灯等。
 
样本准备:收集106细胞,加入150μl SDS裂解液,冰上超声5次,定量。
SDS-PAGE 电泳:
1.准备各溶液。  小烧杯两个,5ml枪头6个,吸水纸,罐胶电泳设备。
2.准备罐胶槽。  将玻璃板擦干净,放入短架子内,薄板靠门,两玻璃板及架子的底缘须在同一平面(否则漏胶);将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜;将短架子装在长架子上(短架子底缘须与垫片紧密接触,否则漏胶)。
3.准备配胶。   将各溶液(ddH2O,单体,Tris-HCl,SDS,TEMED,APS)依次摆好,5ml枪头插于长罐胶槽,调好取TEMED、APS的枪。
4.配分离胶。   在一小烧杯上装半杯ddH2O;另一小烧杯依次加上述各液(加TEMED、APS时要迅速),快速摇匀。
                注:胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。
5.罐胶。        从玻璃板中间注入胶液,注胶速度均匀,不要产生气泡。罐胶后用ddH2O压胶。
6.等待时:      将Tris-HCl换成pH6.8。换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。调好各移液器。
7.30分钟后。   倒掉压胶水,用滤纸吸干残留水,注意不要触及胶面。
8.配集成胶。   参见步骤4。
9.罐胶。        参见步骤5,灌满为止,不要有气泡。
10.插梳。       梳柱下面不要有气泡。
11.等待时。     A:配电泳缓冲液。B:将样本煮沸5分钟。C:水中冷却,短暂离心后依加样序排放好。D:等胶近凝时,将玻璃板装在电泳架子上,罐内槽液于槽中,检查是否密封。E:将上槽架子按于槽中。
12.30分钟后。   罐上槽液超过短玻璃板,拔梳(注意力道适中,不能太快)。放置上样架子。
13.上样30μl。   枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出,使样品液从胶面往上涨,枪头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出,但是每个样品都须同样处理。
14.加外槽液。
15.电泳。
转膜:
1.准备。        分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具,在电泳槽中倒好转膜液
2.揭胶。        电泳结束后,将电泳槽移至水池中,倒掉电泳液,将内槽提起放在水池边,取出两边玻璃板。用纯水冲干净玻璃板,小心揭开短板,去掉集成胶,小心将胶转入转膜液在中。
3.转膜。        将夹子打开,黑色在底,依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵,关好夹子(均在液面下进行,注意气泡)快速放入架子中。在电泳槽中放冰袋。
4.电泳。
封闭及孵抗体:
1.转膜等待时   准备封闭液(即Non-fat milk 5% in TBST)。
2.转膜完毕后,  将膜放入封闭液中,轻摇孵育1小时。
3.孵一抗。      将封闭好的膜在转移到一抗盒子中,室温孵育两小时或4℃过夜,
4.洗涤          将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次,每次5分钟。
5.孵二抗。      将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。
6.洗涤。        将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次,每次5分钟。
7.ECL化学发光和曝光显影。
western-blot凝胶浓度选择:
15%
10-45KD
 
7.5%
35-95 KD
12%
12-60 KD
 
5%
55-220 KD
10%
20-80 KD
 
 
 
 
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